کلونینگ وبررسی انتقال ژن فایتوئین سنتاز گیاه نرگس به کاهو

کاروتنوئیدها یکی از گسترده ترین دسته های ترکیبات غذایی از لحاظ تنوع غذایی هستند. نقش کاربردی کاروتنوئیدها در تغذیه انسان به عنوان آنتی اکسیدان و پیش ماده ویتامین a سبب شده که مصرف پیوسته آنها موجب ایمنی در برابر برخی از بیماریها گردد. بنابراین به خاطر اهمیت کاروتنوئیدها، دستکاری ژن های رمزکننده ی آنزیم های مسیر سنتز این مواد از اهمیت فوق العاده ای برخور می باشد. این طرح به منظور بررسی پتانسیل گیاه خوراکی کاهو برای افزایش میزان کاروتنوئیدها از طریق بیان بیشینه ی کلیدی-ترین آنزیم مسیر سنتز کاروتنوئیدها، یعنی فایتوئین سنتاز، انجام گرفت. برای اینکار ابتدا cdnaی ژن فایتوئین سنتاز که از گیاه نرگس جداسازی گردیده بود، سعی شد تا در وکتور مخصوص انتقال ژن به هسته کلون گردد . با توجه به اینکه محل فعالیت psy (محل سنتز کاروتنوئیدها) در کلروپلاست می باشد، کارآیی مناسب تری در افزایش میزان کاروتنوئید خواهد داشت، برای این منظور باتوجه به محدودیت سایت های برشی برای کلون کردن ژن در یک وکتور پلاستیدی آماده به نام phk20 (xbai,ndei)، مناسب ترین استراتژی این بود که ابتدا باید psy در یک وکتور مناسب کلون می شد تا این دو سایت برشی ایجاد شود. لذا psy از وکتور pma4 جدا و در سایت ecori وکتور پایه pmcs5 کلون شد. باتوجه به امکان ایجاد لیگاسیون زیاد، از سیستم گزینشی blue-white برای گزینش کلون های نوترکیب استفاده شد. در مرحله بعدی psy با استفاده از آنزیم های xbai و ndeiجدا شده و با ژن nptii در وکتور phk20 جایگزین گردید. از آنجا که کشت بافت و اندام زایی اساس موفقیت در هر آزمایش انتقال ژن و به ویژه در انتقال ژن به کلروپلاست می باشد، بنابراین جهت افزایش کارآیی لازم است تا پارامتر-های مختلف جهت انتقال ژن بهینه سازی شود. از پارامترهای مهم در انتقال ژن به روش ریز پرتابی، نوع ذرات مورداستفاده، فشار پرتاب، فاصله ی آداپتور تا بافت های هدف و تفاوت در نوع کاشت و پرورش گیاه می باشد که در این تحقیق مورد ارزیابی قرارگرفت. با بررسی بیان موقت ژن gus در برگ های شلیک شده پس از یک روز، ذرات طلا و فشار psi 1350 در فاصله cm 5/3 آداپتور از بافت برگی گیاهان کاهوی کشت شده در محیط in vitro به عنوان بهترین تیمارها شناخته شدند. بهینه سازی پارامترهای موجود در این روش می تواند موجب افزایش کارآیی این روش شده و احتمال موفقیت در انتقال ژن به کلروپلاست گیاه کاهو را افزایش دهد.